PRUEBA DE PCR EN TIEMPO REAL

Si bien Laboratorio Azul venía explorando hace muchos años las técnicas de PCR aplicadas a la detección de enfermedades venéreas de los bovinos, a partir del año 2018 comenzó a trabajar en la implementación de la técnica de PCR en Tiempo Real (Real Time PCR ó qPCR) para el diagnóstico de Tricomonosis y Campylobacteriosis con el fin de demostrar su eficacia comparativa con las técnicas tradicionales de cultivo (Tricomonosis) e IFD (Campylobacteriosis). 

 Por el lado de la Tricomonosis, la qPCR demostró un aumento significativo de la sensibilidad diagnóstica, obteniendo muestras positivas que no habían sido detectadas por cultivo. El análisis de la detección de las muestras positivas, en los distintos raspados, evidencia un aumento de la sensibilidad al primer raspado obteniendo el 81.3% del total de muestras positivas; alcanzando el 94.9% en el segundo raspaje con el uso combinado del cultivo y qPCR. 

 En el caso de Campylobacteriosis, de las 1145 muestras procesadas, 1.088 (95%), coincidieron en su resultado por ambas técnicas (48 positivas y 1.040 negativas), siendo moderado el valor de concordancia kappa entre IFD y qPCR (gen nahE) (k= 0,6). 

 Finalmente podemos determinar, luego de este primer año de trabajo realizado sobre muestras prepuciales de toros preservicio, que el 69% de los campylobacter detectados corresponden a la subespecie C. fetus venerealis y el 31% restante a la subespecie C. fetus fetus.

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También puede visualizar la charla virtual a cargo del MV Gustavo Combessies que se encuentra abajo.

PRUEBA DE PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA) PARA LA DIFERENCIACIÓN DE TRITRICHOMONA FOETUS DE OTRAS TRICOMONAS NO PATÓGENAS

En 1999 (1) se describe la presencia de Trichomonas no patógenas en los medios de cultivo provenientes de toros vírgenes, con características de desarrollo similares a Tritrichomona foetus. Las mismas resultaron difíciles de diferenciar por el microscopio óptico y se debió recurrir a la utilización de la microscopía electrónica para demostrar la presencia de diferentes número de flagelos de los tres que tiene T. foetus (Foto 1-4).

Tritrichomona foetus obtenida en Laboratorio Azul, 2005. Servicio Microcopía Electrónica INTA Castelar, Argentina.
Tetratrichomona spp. obtenida en Laboratorio Azul, 2005. Servicio de Microscopía Electrónica INTA Castelar, Argentina.
Trichomonas no patógenas obtenidas en Laboratorio Azul con 2 y 1 flagelo.Servicio de Microscopìa Electrónica. INTA Castelar, Argentina.
Trichomonas no patógenas obtenidas en Laboratorio Azul con 2 y 1 flagelo.Servicio de Microscopìa Electrónica. INTA Castelar, Argentina.

El desarrollo de una Técnica de PCR capaz de amplificar zonas de DNA espec&íacute;ficas de género y especie permitió acceder a la identificación de T. foetus y diferenciarla de otras Trichomonas no foetus (foto 5) (2). Mediante la utilización de dos pares de primers, TFR1 y TFR2 específico de género y TFR3 y TFR4 específico para T. foetus, se realiza la reacción de PCR en el termociclador y se corren las muestras en un gel de agarosa. Las muestras positivas al cultivo en los medios habituales deben presentar la banda de género Trichomona y la banda específica de T. foetus para confirmar la presencia del patógeno. Esta técnica ya se realizó en el Laboratorio de Producción Animal de INTA Balcarce y se comunicó su habilidad para diferenciar estas Trichomonas ( 3). LABORATORIO AZUL, en un esfuerzo tecnológico, implementó esta prueba que ayuda a develar una duda que se presenta asiduamente en el diagnóstico rutinario de esta patología que sigue siendo una de las mas importantes que afectan nuestros rodeos.

A modo de ejemplo mostramos un gel (foto 5) donde se observa la primer calle con el marcador de peso molecular. Las calles 2 a 9 son diferentes muestras de campo (M1 a M8) enfrentadas con los primers que identifican género. La calle 10 corresponde al control positivo de T. foetus que también debe responder a los mismos primers de género. De las calles 11 a 18 se repiten las mismas muestras de campo (M1 a M8) pero enfrentadas a los primers específicos de T. foetus. La calle 19 es el mismo control positivo a T.foetus y la calle 20 es el control negativo.

Servicio de Microscopía Electrónica. INTA Castelar, Argentina.

Como resultado se observan muestras positivas a T. foetus en las calles 17 y 18 (M7 y M8) mientras que las que se procesaron en las calles 11 a 16 (M1 a M6) pertenecen al género Trichomonas (porque presentan bandas con los TFR1 y 2) pero son NO foetus porque no presentan bandas con los primers específicos TFR3 y 4.

BIBLIOGRAFÍA

  • BonDurant R., Gajadhar A., Campero C.M., Johnson E., Lun Z., Nordhausen R., Van Hooser K., Villanueva M., Walker R. 1999. Preliminary characterization of a Tritrichomnas foetus-like protozoan isolated from preputial smegma on virgin bulls. The Bovine Practitioner 33: 124-127.
  • Felleisen R., Schimid-Lambetlet N., Walubengo J. 1997. Comparative evaluation of methods for thediagnosis of bovine trichomonas foetus infection. J. Protozzol. Res. 7:90-101.
  • Cobo E.R., Odeón A., Cipolla A., Campero C.M., 2002. Aplicación de PCR( Polymererase Chain Reaction) en la confirmación del diagnóstico de la tricomoniasis bovina. XIVa. Reunión anual de la AAVLD (Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico) 13 al 15 de Noviembre de 2002, Villa Gral. Belgrano, Sierras de Córdoba.
  • Mutto Adrián. 2003. Identificación y Diagnóstico de Tritrichomonas foetus, Campylobacter fetus subsp.venerealis y Campylobacter fetus subsp. Fetus por PCR en ganado bovino. Tesis. Universidad Nacional de San Martín. Instituto deInvestigacionesBiotecnológicas de Chascomus.IIB-INTECH/UNSAM-CONICET.

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Dr. Alfredo Martínez – amartinez@laboratorioazul.com.ar
Dr. Gustavo Combessies – gmcombessies@laboratorioazul.com.ar